FluorCam多光譜熒光成像應(yīng)用于分子生物學(xué)研究——

擬南芥基因敲除：對(duì)一種病毒產(chǎn)生抗性，卻引發(fā)另一種病毒易感？

馬鈴薯 Y 病毒屬（Potyvirus），是一類(lèi)嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)生產(chǎn)的植物病毒屬，有數(shù)百個(gè)種，包括大豆花葉病毒（SMV）、三葉草黃脈病毒（CIYVV）、蕪菁花葉病毒（TuMV）deng 等。植物中的翻譯起始因子4E是對(duì)馬鈴薯Y病毒屬敏感的一個(gè)小家族。當(dāng)作物中編碼eIF4E蛋白的天然抗性等位基因缺失時(shí)，敲除這些4E家族基因，可以賦予作物遺傳抗性。eIF4E1是4E家族中一個(gè)對(duì)CIYVV敏感的翻譯起始因子，本研究探討了利用敲除eIF4E1對(duì)擬南芥的病毒抗性的雙重影響.

研究結(jié)果表明，敲除eIF4E1后，對(duì)CIYVV敏感的植株對(duì)三葉草黃脈病毒（ClYVV）表現(xiàn)出抗性，但對(duì)蕪菁花葉病毒（TuMV）的敏感性顯著增強(qiáng)。而通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建功能抗性等位基因eIF4E1可避免對(duì)TuMV的超敏反應(yīng)，同時(shí)保留對(duì)ClYVV的抗性。研究提示，基因敲除策略可能因病毒利用其他同源因子而存在風(fēng)險(xiǎn)，而模擬天然抗性等位基因是更安全有效的策略。

  FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)，除了具備葉綠素?zé)晒獬上?，可以檢測(cè)植物光合活性以外，還具備多光譜熒光成像功能，比如FPs熒光蛋白成像、UV-MCF紫外激發(fā)多光譜熒光成像等。在這項(xiàng)研究中，FluorCam便承擔(dān)了檢測(cè)在病毒侵染下不同基因型擬南芥的衰老、追蹤GFP標(biāo)記病毒分布及量化的雙重角色。

n eIF4E1功能喪失與TuMV感染癥狀加重有關(guān)

使用帶GFP標(biāo)記的TuMV（TuMV-GFP UK1）感染三個(gè)基因型的擬南芥，分別為野生型WT；敲除eIF4E1對(duì)CIYVV具抗性的基因型（eif4e1^KO）；敲除eIFiso4E對(duì)TuMV具抗性的基因型（eifiso4e^KO）。使用FluorCam檢測(cè)感染14天、21天之后擬南芥葉綠素?zé)晒庾兓ū碚魅~片衰老情況）及GFP表達(dá)情況（即TuMV病毒積累程度）。從結(jié)果可知，eifiso4e^KO因其具備的病毒抗性，而無(wú)明顯的病毒侵染，性狀和葉綠素?zé)晒馑綗o(wú)明顯變化，而eif4e1^KO的GFP信號(hào)更強(qiáng)，說(shuō)明其病毒積累更多，葉綠素?zé)晒獬上窠Y(jié)果也顯示，其感染癥狀比野生型更為明顯，表現(xiàn)為更嚴(yán)重早衰（葉綠素?zé)晒庀陆担⑿氯~發(fā)育停滯。

n 基因功能驗(yàn)證：

? 恢復(fù)eIF4E1表達(dá)后，植株對(duì)TuMV的敏感性和病毒積累量恢復(fù)至野生型水平

為了確認(rèn)eif4e1^KO對(duì)TuMV易感是否由eIF4E1缺失有關(guān)，通過(guò)構(gòu)建了兩個(gè)互補(bǔ)系eif4e1KO;eIF4E1-1和eif4e1KO;eIF4E1-2，在感染TuMV-GFP UK1后，于17天后，分析了它們的表型。FluorCam成像結(jié)果表明，eif4e1KO;eIF4E1-1和eif4e1KO;eIF4E1-2的病毒易感性表現(xiàn)恢復(fù)到了與野生型相似水平，比eif4e1^KO具有更高的TuMV抗性，證明了eIF4E1的敲除缺失是eif4e1^KO突變體易感性和病毒積累增加的原因。

?  CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將eIF4E1轉(zhuǎn)化為抗性等位基因eIF4E1^N176K  

研究中，模擬豌豆eIF4E等位基因中與抗馬鈴薯病毒屬相關(guān)的自然突變基因，通過(guò)基因編輯的方法獲得非轉(zhuǎn)基因的eIF4E1^N176K植株，侵染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明，該基因編輯株對(duì)TuMV無(wú)超敏反應(yīng)，且保留對(duì)ClYVV的抗性。  

結(jié)合研究中的其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出結(jié)論，敲除eIF4E1雖賦予植株ClYVV的抗性，但卻引發(fā)了對(duì)TuMV的過(guò)度敏感。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)模擬天然抗性等位基因是更優(yōu)策略，既可維持抗性，又避免對(duì)其他病毒的易感性。研究強(qiáng)調(diào)基因敲除抗性育種存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，而功能性等位基因編輯更具應(yīng)用前景。

n FluorCam多光譜熒光成像助力葉片衰老和病毒感染程度檢測(cè)

作為研究中的主要檢測(cè)手段，FluorCam提供了多方面的數(shù)據(jù)支撐。葉綠素?zé)晒獬上窠Y(jié)果體現(xiàn)了葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化量化葉片衰老進(jìn)程，直觀反映病毒感染引發(fā)的早衰現(xiàn)象，從而反映葉片衰老。得力于系統(tǒng)非侵入性檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)追蹤植株生理狀態(tài)，避免傳統(tǒng)取樣對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾和珍貴樣品的破壞。而系統(tǒng)具備的GFP熒光蛋白檢測(cè)則為可視化病毒分布、量化病毒積累提供、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)感染不同階段病毒與宿主互作的時(shí)序性變化提供了可靠數(shù)據(jù)。FluorCam兼具的兩項(xiàng)技術(shù)共同為擬南芥抗病毒分子生物學(xué)研究提供了高效、直觀的表型和分子水平分析工具。

參考文獻(xiàn)：

Zafirov, Delyan, et al. "When a knockout is an Achilles’ heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana."Molecular Plant Pathology, 22.3 (2021): 334-347.